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蛋白定制丨高產(chǎn)量高質(zhì)量的原核/真核蛋白表達系統(tǒng)
來源：戴安生物
發(fā)布時間：2023-12-22
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生命科學研究在各個領域的滲透，越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)。利用蛋白表達系統(tǒng)表達目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。重組蛋白表達技術通過載體將目的基因導入宿主細胞，借助宿主的蛋白表達生產(chǎn)機制生產(chǎn)目標蛋白。大腸桿菌、酵母、昆蟲、哺乳動物等原核或真核細胞用作宿主細胞，配合豐富多樣的載體，為蛋白質(zhì)研究奠定了堅實基礎。
四大蛋白表達系統(tǒng)
1. 原核表達系統(tǒng)
原核和真核動物細胞表達系統(tǒng)之間的主要區(qū)別在于基礎構造不同。原核細胞的細胞壁及其簡單的構造可承受劇烈的溫度變化并在熱沖擊過程中生存，且沒有細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體等細胞運輸和翻譯后修飾的關鍵元器。
大腸桿菌E.coli蛋白表達系統(tǒng)，大腸桿菌是工業(yè)中大規(guī)模生產(chǎn)用于治療用途蛋白質(zhì)（特別是非糖基化蛋白質(zhì)）的首選表達宿主，具有遺傳背景清晰、增殖快、表達水平高、抗污染能力強、培養(yǎng)條件簡單、經(jīng)濟實惠等優(yōu)點。但也存在一些問題：易形成包涵體、內(nèi)毒素殘留、不能進行翻譯后加工修飾等。
應用范圍：無需特殊修飾蛋白，如細胞生長因子、抗原、重組蛋白等，應用于制備抗原、蛋白酶活性檢測、蛋白互作、分子免疫學、結構生物學等領域。
推薦用途：治療性蛋白，工業(yè)化酶，抗原，功能及結構研究。
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2. 真核表達系統(tǒng)
天然存在的大部分蛋白質(zhì)需要在表達后進行復雜的翻譯后修飾，如糖基化，才可以發(fā)揮其正確的生物學功能。原核表達系統(tǒng)基因組簡單，不能表達翻譯后修飾所需的酶。真核表達系統(tǒng)擁有更復雜的蛋白表達機制和更高的翻譯精度。具有翻譯后加工修飾體系，可以表達分泌復雜的蛋白質(zhì)，表達的外源蛋白更接近于天然蛋白質(zhì)。在制藥領域，世界上幾乎所有的生物制藥公司都依賴于使用基于真核動物細胞的穩(wěn)定細胞系來生產(chǎn)生物制劑。
真核哺乳細胞模擬圖
真核表達系統(tǒng)主要包括酵母系統(tǒng)、昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)、以及哺乳動物細胞系統(tǒng)。
酵母表達系統(tǒng)代表有釀酒酵母、甲醇酵母等。酵母表達系統(tǒng)具有翻譯后糖基化機制接近高等真核生物、易實現(xiàn)高密發(fā)酵，經(jīng)濟、快速、產(chǎn)量高等優(yōu)點，缺點為表達的蛋白質(zhì)糖基化與人源糖基化有較大差異，如甘露糖修飾比例高。一般用來表達細胞因子、小分子類蛋白、酶類等相關產(chǎn)品。酵母表達系統(tǒng)發(fā)酵密度高時，酵母的蛋白酶能夠降解表達的目的蛋白，引起目的蛋白C端或N端氨基酸降解，因此用于該系統(tǒng)生產(chǎn)的相關產(chǎn)品對于產(chǎn)品完整性的檢測至關重要。
昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)周期相對較短。該系統(tǒng)載體的構建主要針對桿狀病毒，而非昆蟲細胞系本身，大大縮短了從基因克隆到蛋白表達的時間。
哺乳動物細胞表達系統(tǒng)適合表達糖基化蛋白和空間結構較復雜蛋白質(zhì)，表達產(chǎn)物一般存在于細胞質(zhì)中。通常在基因構建時在目的蛋白前加一段信號肽，使表達產(chǎn)物會分泌到細胞外。哺乳動物細胞具有較好的翻譯后修飾系統(tǒng)，表達的蛋白生物學活性更加接近天然蛋白。常用的哺乳動物細胞中，倉鼠細胞有CHO，BHK等，人類細胞包含293、HT-1080、HuH-7等，老鼠細胞常用NS0、Sp2/0等，其中，CHO細胞表達體系已經(jīng)成為生物制藥最重要的表達系統(tǒng)。
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3.?表達系統(tǒng)的選擇
各表達系統(tǒng)特點
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選擇合適的宿主系統(tǒng)至關重要，有文獻數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2014年PDB中記錄的重組蛋白有超過88%的重組蛋白是由大腸桿菌表達的。但對于治療性重組蛋白、病毒載體和疫苗生產(chǎn)而言，最主要的平臺是真核動物細胞表達系統(tǒng)。
選擇表達系統(tǒng)主要考慮蛋白質(zhì)的大小、需要表達的蛋白的量、蛋白來源的物種，以及蛋白質(zhì)是否有二硫鍵和翻譯后修飾。另外宿主本身的特性、載體質(zhì)粒的選擇等因素都會影響最后蛋白表達的結果。
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原核E.coli表達系統(tǒng)不僅修飾和折疊功能不完善，當目標蛋白大于50kDa 時可能還表達出不完整蛋白。真核哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，除了成本高和相對復雜之外，似乎也沒什么缺點，隨著表達技術不斷突破，已逐步成為主流系統(tǒng)。
哪些情形更適合用真核表達呢？下面我們以碰到的真實案例舉例：
1.蛋白來源于真核，因真核密碼子偏好更適合用真核表達。
2.膜蛋白、細胞因子類蛋白或大分子蛋白，原核系統(tǒng)不表達的或只形成包涵體，可嘗試真核表達。
3.需要活性蛋白。
4.重組抗體的表達。
5.想制備一個重要的IP或流式應用的抗體，推薦表達真核蛋白作為抗原免疫動物。
6.因物種特殊等原因市面買不到的蛋白。
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FOLR2_MOUSE，蛋白質(zhì)表達項目（C3028）
項目前分析：
項目建議：用293細胞表達全長蛋白
?真核表達蛋白表達膠圖驗證：
（泳道4和6均為蛋白洗脫液，可見蛋白表達成功）
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