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重組蛋白中Flag標簽的應用原理與特點
來源：戴安生物
發布時間：2023-11-16
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在重組蛋白表達中，選用合適的蛋白標簽可控制蛋白質固定的空間取向、簡化蛋白質的純化過程以及方便檢測、使體內生物事件可視化，提高重組蛋白的產量、增強重組蛋白的可溶性和穩定性等。
根據自身分子量大小的不同，親和標簽可分為兩大類: 一類是結合固定化配基的短肽標簽，如Strep-tagⅡ、FLAG-tag、His-tag等; 另一類是識別小分子配基的蛋白標簽，如MBP、GST等。而根據結合配基分子量大小的不同，親和標簽也可以分為兩大類: 一類是與小分子配基結合的短肽或蛋白標簽，如結合固定化金屬的His 標簽、結合固定化谷胱甘肽的GST 標簽等; 另一類是與蛋白配基結合的短肽標簽，如結合固定化鈣調蛋白的CBP 標簽等。
Flag標簽系統
今天講的Flag標簽，是通過DNA基因重組技術將一個短的親水性八氨基酸短肽(DYKDDDDK)，分子量約為1.0kDa，融合到目標蛋白中，從而形成融合蛋白。Flag標簽可添加到蛋白質的N端或C端，由于尺寸小，親水性強，不會對蛋白表達、蛋白水解成熟、抗原性等造成影響，可廣泛運用于各種細胞類型中，包括細菌、酵母及哺乳動物等。Flag標簽抗體能夠特異性的與標簽蛋白上的Flag標簽結合，用于標簽蛋白的純化、定性定量檢測蛋白表達水平、細胞內定位等實驗。
Flag標簽的特點：
1.序列較短，僅有八個氨基酸序列，只用一條人工合成的寡核苷酸鏈就可以編碼。
2. Flag標簽融合蛋白的構象，在結晶條件下與單純目的蛋白的構象幾乎一樣，一般不會與目的蛋白相互作用，對目的蛋白的性質和功能影響甚微，這一優勢特點便于利用Flag標簽對融合蛋白進行下游研究。
3.融合Flag標簽后，可直接通過標簽對目的蛋白進行親和層析，通過非變性純化條件，可純化得到活性融合蛋白，且具有較高的純化效率。
4. Flag抗體可特異性與標簽蛋白上的Flag標簽結合，可在ELISA、WB等實驗中對含有Flag的融合蛋白進行有效檢測、鑒定。
5. Flag-Tag序列中含有一個腸激酶（enterokinase）切割位點（DDDDK-X1），腸激酶可識別標簽中C端的五個氨基酸( Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，通過腸激酶處理切割標簽后即可獲得天然的非融合蛋白質。
Flag標簽的作用原理：
Flag-Tag雖序列簡單，但其中的8個氨基酸的排列并非隨意，其位置和序列與Flag的抗原作用密切相關。
1. Flag-Tag序列的第二個氨基酸是酪氨酸(Tyr)，為芳香族氨基酸，是抗原-抗體特異性反應的主要因素。
2. N端帶負電的天冬氨酸(Asp)與酪氨酸(Tyr)左側相連，相比于在低極性環境中，在高極性環境中參與抗原性位點的芳香族氨基酸產生作用的可能性更高，Asp可以輔助Tyr的抗原性。
3. Tyr下游的六個氨基酸殘基( Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)是一個六肽序列KDDDDK，形成了一個高度暴露的三維結構，達到最大的親水性，從而使Flag融合標簽展示出很強的抗原性。
通過這樣一個特殊有序的氨基酸序列，Flag-Tag以最短的形式高效地展示出表達親和標簽的作用。
抗Flag標簽抗體
根據不同的抗原結合要求，目前已開發出3種Flag標簽抗體并上市使用，分別是M1、M2和M5。
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M1單抗是最早被應用的，常用于N端融合Flag標簽的融合蛋白的純化和鑒定。M1單抗的結合主要在前四個氨基酸，并要求具有自由的N末端，且必須在Ca2+的參與下才能和Flag抗原結合。
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M2單抗克服了M1依賴Ca2+的缺陷，與Flag標簽的結合不依賴與Ca2+，因此吸附了抗體后的抗原不能被螯合劑入EDTA等從吸附柱上洗脫。該抗體允許Flag序列前面有多余的氨基酸如Met存在，它的優勢是可應用于在真核系統表達中具有N端Met-Flag-結構的重組蛋白，還可以識別并結合C端融合Flag標簽的重組蛋白。
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與單抗M2的作用特點類似，M5單抗（戴安貨號：2064）不依賴于Ca2+，多應用于類似N-Met-Flag-C的序列，對融合蛋白的親和力非常高，是用于檢測在真核細胞質表達的Flag融合蛋白質的首選抗體。
Flag標簽抗體的應用
1. 應用于融合蛋白的純化和檢測：抗Flag融合標簽抗體（戴安貨號：2064）與目的蛋白的特異性結合，可對蛋白進行親和純化（戴安Flag標簽蛋白純化試劑盒貨號KAP0064）；也可直接通過酶聯免疫吸附實驗( ELISA)、免疫印跡（WB）等方法檢測表達產物的蛋白質水平。
Flag標簽鼠單抗 WB檢測（CAT:2064）
Flag融合標簽蛋白純化試劑盒純化蛋白結果（Cat：KAP0064）
2. 應用于相互作用的蛋白質挖掘：將抗Flag標簽的抗體進行熒光標記后，用于尋找與融合蛋白相互作用的蛋白，包括配體或者受體；利用Flag標簽抗體沉淀與目的蛋白相互作用的蛋白，通過分離純化與鑒定，便于進一步的結構及功能分析，獲取更多互作蛋白信息。
3. 應用于蛋白質的結構和功能探索：抗Flag標簽抗體可應用與蛋白質分子的功能研究，尤其在膜受體的功能研究領域；可利用抗標簽蛋白抗體的交聯活化受體代替天然配體來研究受體的信號轉導或功能；將標簽插入信號轉導分子的特定結構域還可以用來研究分子的信號轉導途徑。
Flag標簽抗體相關文獻列表(精選）
| 文獻 | 貨號 |
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1. CDK4/6 inhibition triggers ICAM1-driven immune response and sensitizes LKB1 mutant lung cancer to immunotherapy. |
2064 |
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2. DIAPH3 condensates formed by liquid-liquid phase separation act as a regulatory hub for stress-induced actin cytoskeleton remodeling. |
KAP0064 |
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3. Functional characterization of IL-18 receptor subunits, IL-18Rα and IL-18Rβ, and its natural inhibitor, IL-18 binding protein (IL-18BP) in rainbow trout Oncorhynchus mykiss. |
IP0064S |
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4. Genome-Wide CRISPR-Cas9 Screen Identifies SMCHD1 as a Restriction Factor for Herpesviruses. |
2064 |
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5. MicroRNA miR-155 inhibits cyprinid herpesvirus 3 replication via regulating AMPK-MAVS-IFN axis. |
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6. SEPT2 Protein Crotonylation Promotes Metastasis and Recurrence Through AKT Pathway in Hepatocellular Carcinoma and is Associated with Poor Survival. |
IP0064 |
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7. Retinitis pigmentosa 2 pathogenic mutants degrade through BAG6/HUWE1 complex. |
2064 |
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8. Molecular and functional characterization of zinc ?nger aspartate-histidine-histidine-cysteine (DHHC)-type containing 1, ZDHHC1 in Chinese perch Siniperca chuatsi. |
2064 |
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9. Molecular and functional identification of a short-type peptidoglycan recognition protein, PGRP-S, in the Chinese soft-shelled turtle Pelodiscus sinensis. |
2064 |
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10. Functional characterization of IL-10 and its receptor subunits in a perciform fish, the mandarin fish, Siniperca chuatsi. |
KAP0064 |
